Cómo analizar datos de Western Blot

Manchas blancas /negras occidentales son una técnica de electroforesis de gel que analizan el contenido de proteína de una muestra biológica. Esta técnica es un procedimiento estándar en laboratorios de investigación biológica y también puede utilizarse en medicina forense o diagnósticos biomédicos.

Manchas blancas /negras occidentales toman proteína purificada a partir de una muestra de tejido y sujeto a un proceso llamado SDS PAGE, donde las proteínas son separadas por peso usando una corriente eléctrica. Una vez que se separan las proteínas, puede ser transferidos a una membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF) y analizados para diferentes proteínas de interés.

Instrucciones

Desarrollan un Gel de Western Blot para la proteína de interés

• Lavar cuidadosamente la membrana PVDF en solución TBST. Colocar la membrana en un recipiente rectangular con TBST y coloque en una coctelera de inclinación o rotación a baja velocidad (80 a 90 hertzios) durante 10 minutos. Descarga el TBST hacia fuera y repetir este lavado.

• Lavar la membrana en solución amortiguadora de bloqueo. Derramar la solución TBST y vierta una cantidad equivalente de solución amortiguadora de bloqueo en el envase. Coloque el recipiente en un agitador a baja velocidad durante una hora.

• Mezclar el anticuerpo primario mientras se espera la solución amortiguadora de bloqueo completar. Compruebe su anticuerpo para ver qué dilución se recomienda por el fabricante y diluir en consecuencia. Por ejemplo, si su anticuerpo debe ser mezclado en una dilución de 1:5,000, puede medir 10 ml de tampón de bloqueo y añadir 2 μl (microlitros) de anticuerpo primario.

• Verter la solución amortiguadora de bloqueo y añadir la solución de anticuerpo primario al contenedor. La muestra de anticuerpo y el tejido varía según la cantidad de tiempo necesario para incubar el anticuerpo primario con la membrana PVDF. El procedimiento más común es colocar la membrana en un agitador a baja velocidad a 4 grados C (en nevera) durante 16 a 18 horas. Su anticuerpo debe venir con un tiempo de incubación recomendados.

• Enjuagar la membrana PVDF. Derramar el anticuerpo primario y enjuagar la membrana durante 10 minutos en TBST a temperatura ambiente. Repita esto lavar paso dos o tres veces.

• Incubar la membrana en el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario viene con la dilución recomendada. Por ejemplo, si la dilución recomendada es de 1:10, 000, puede añadir 1 μl a 10 ml de solución amortiguadora de bloqueo. Asegúrese de que el anticuerpo secundario se etiqueta "HRP-conjugado" porque otros anticuerpos no pueden funcionar correctamente con kits de ECL.

• Desarrollo de la membrana PVDF usando un sistema comparable de la quimioluminescencia o ECL. Revise las instrucciones que vienen con su kit de ECL para ver cómo mezclar la solución en desarrollo y cómo desarrollar correctamente la membrana.

Desarrollo de la membrana PVDF

• Exponer una película a la membrana. A 10-15 minutos de ECL desarrollar, llevar la membrana PVDF a un cuarto oscuro. En completa oscuridad, exponer una película en blanco a la membrana y colocar en la máquina en desarrollo del cuarto oscuro.

• Una vez que la película sale el desarrollador, encender las luces y ver si la película se desarrolla adecuadamente. Si la película es demasiado ligera, necesita exponer una nueva película por más tiempo. Si la película es demasiado oscura, puede intentar exponer otra película de un minuto o 30 segundos.

• Tenga en cuenta el tiempo de exposición que crea una película bien desarrollada. Puede utilizar este tiempo para todas las ejecuciones posteriores de este procedimiento.

• Escanear la película desarrollada en un ordenador con el escáner. Con la mayoría de los exploradores, puede colocar la película en el cristal del escáner y pulse un botón. Consulte la documentación que acompaña el escáner para determinar si éste es el procedimiento adecuado. Una vez escaneada en la película, guarda la imagen con un nombre descriptivo que usted será capaz de reconocer más tarde.

• Abrir la imagen guardada en el programa ImageJ. ImageJ es desarrollado por los institutos nacionales de salud (NIH) y está disponible gratis en línea.

Comparar bandas en las películas reveladas

• Obtener una medida de fondo. Hacer una selección rectangular alrededor de la banda más grande en el Western blot utilizando la herramienta de selección (el primer icono en la barra de herramientas). Luego mover el rectángulo a un área vacíelo, de la película. Mantenga presionado Control + M para medir la oscuridad de fondo.

• Mover el rectángulo a la primera banda en la película y presiona Control-M otra vez. Repetir este proceso en secuencia para todas las bandas en la película que desea analizar.

• Copiar los datos de la banda. Cuando usted comienza la medición, aparecerá una ventana de "Resultados". Una vez que termines de medición, resalte todos los datos de medición y pulsa Control+c para copiarlo. Abra su programa de hoja de cálculo y presiona Control V para pegar los datos de medición. Datos todo pegados de la etiqueta cuidadosamente y guarde el archivo de datos cuando termines todas las películas de medición.

• Determinar la densidad de cada banda. El valor de su medida de fondo debe ser el número más alto ya que es más brillante que las bandas sombreadas de su Western blot film. Restar los valores de medición de la banda del valor de fondo para determinar su densidad relativa. Por ejemplo, si el valor de su fondo es de 200 y tiene cuatro bandas con valores de brillo de 150, 170, 180 y 190, entonces los valores finales para las cuatro bandas son 50, 30, 20 y 10.

• Comparar grupos experimentales utilizando cualquier análisis estadístico que se desea aplicar. Mayoría de los experimentos utiliza una técnica denominada ANOVA (análisis de varianza) para comparar los valores a través de grupos. Muchos paquetes de estadísticas como PSAW tienen estadísticas incorporado procedimientos realizar ANOVAs en datos con formato correcto.

Consejos y advertencias

  • Mezclar la solución amortiguadora de bloqueo inmediatamente antes del principio lavados. Solución amortiguadora de bloqueo puede ser fácilmente contaminado y sólo permanece fresco durante varios días.
  • Siempre revise la hoja de datos material de seguridad para determinar los procedimientos de seguridad adecuados al manipular productos químicos.
  • Nunca exponga la película subdesarrollada a la luz. Esto puede dañar la película.

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